Técnica do DNA complementar (cDNA)
A técnica do DNA complementar é método utilizado para obter bibliotecas genómicas sendo vezes útil para a técnica de DNA recombinante. O seu DNA tem origem em mRNA que já sofreu o processo de splicing, ou seja,
mRNA maduro formado por complementaridade de bases. Este Arn não possui intrões pelo que a cadeia de DNA sintetizada não tem informação desnecessária
O processo de ADN complementar necessita da utilização da enzima transcriptase reversa que permite obter DNA a partir de RNA. Após a formação da cadeia através da transcriptase reversa, uma enzima viral, dá-se a formação de outra cadeia por acção da DNA polimerase, formando-se assim uma molécula de DNA estável de dupla cadeia a partir dos nucleótidos dispersos no meio.
A molécula de DNA formada passa assim a fazer parte do material genético da célula alvo sob a forma de um plasmídeo que também codifica informação para a síntese proteica. Sendo a molécula de RNA instável e numericamente limitada, a utilização da transcriptase reversa para a obtenção do seu DNA complementar abriu um importante caminho para a biologia molecular. Desta forma, a possibilidade de se trabalhar com cDNA ao contrário de RNA tem facilitado o trabalho de investigadores, já que esta é quimicamente estável, de fácil manuseamento e a sua multiplicação é possível graças a técnicas como a PCR.
Esta técnica revolucionou o campo da biologia molecular, uma vez que permitiu alterar o genoma de diferentes organismos de modo a os tornar úteis ao ser humano.
Técnica do DNA recombinante (cDNA)
Durante 25 anos a comunidade científica deparou-se com o problema de encontrar um gene e de o separar da restante cadeia polinucleotídica.
O isolamento de substâncias capazes de
fragmentar e ligar o DNA em locais específicos, sendo estas as enzimas de restrição e DNA ligases, respectivamente, deu um grande impulso à Engenharia Genética. Esta descoberta proporcionou à Ciência a capacidade não só de manipular genes, mas também de os transferir entre moléculas de DNA, surgindo deste modo a Técnica de DNA Recombinante.
As enzimas de restrição são substâncias responsáveis pela cisão da cadeia de DNA ao encontrar uma sequência de bases específica, chamada zona de restrição. As enzimas, após o reconhecimento destas sequências (de 5’ para 3’), destroem a ligação fosfodiéster entre dois nucleótidos consecutivos (os dois primeiros da cadeia reconhecida e os dois últimos da cadeia oposta), fragmentando o DNA e dando origem às extremidades coesivas, que contêm a sequência reconhecida. Estes fragmentos podem ser combinados com outras pequenas porções de DNA pela acção de DNA Ligases.
As especificidade das sequências reconhecidas está na base da existência de um grande número de diferentes enzimas de restrição, que originam assim cadeias com diferentes sequências.
Inicialmente dá-se a cisão do DNA da molécula dadora por acção de uma enzima de restrição especifica para a sequência em causa, isolando-se o gene que se pretende manipular. Por actuação dessa mesma enzima no vector, e posterior uso de DNA ligases, é possível incorporar esse mesmo gene neste. No caso das bactérias, esse vector é frequentemente um bacteriófago.
A entidade receptora é colocada em contacto com o bacteriófago, ou outro vector, de modo a que o DNA deste seja incorporado sob a forma de um plasmídeo junto a esta.
Esta técnica traz grandes vantagens para o nosso quotidiano, permitindo produzir proteínas raras em grandes quantidades para o tratamento de doenças e fabrico de vacinas. Além disso contribui para o melhoramento animal e vegetal, bem como para a terapia genética.
Reacção de Polimerização em Cadeia (PCR)
Kary Mullis é tido como pai da técnica de PCR, uma vez que em 1983 desenvolveu estudos que permitiram pela primeira vez a obtenção de cópias de DNA através de uma só molécula inicial. O processo fundamental que se encontra por de trás desta técnica é a replicação de DNA “in vivo”.
Inicialmente, extrai-se o fragmento de material genético a estudar da célula sem o danificar. Depois de extraído, é adicionado ao fragmento uma mistura que contém nucleótidos e a enzima DNA polimerase. Toda esta mistura é colocada numa máquina de PCR especializada, o termo-ciclador, que executa ciclos de temperatura preestabelecidos com tempos exactos. Na primeira etapa do ciclo, a temperatura é elevada a 94ºC num pequeno espaço de tempo para que ocorra a separação da dupla cadeia de DNA a amplificar. Na segunda etapa do processo, dá se uma diminuição da temperatura para cerca de 60ºC, de modo a que os iniciadores (segmentos de DNA em cadeia simples e geralmente constituídos por 15 a 30 nucleótidos), obtidos por síntese química, sem emparelhem com o DNA. Para amplificar uma determinada zona são necessários dois iniciadores complementares das sequências que se encontram no inicio do fragmento de ADN a amplificar, nas terminais 3’, de forma a permitir a actuação da DNA polimerase durante a síntese da cadeia complementar. Numa ultima etapa, a temperatura é elevada a 72º para que a DNA polimerase possa actuar, sintetizando a nova molécula a ser formada.
O resultado de todo este processo é visualizado e analisado através de uma electroforese em gel de agarose.
Impressões digitais genéticas ou DNA fingerprinting
A estrutura de DNA de cada ser vivo é única. Usando somente as sequências que determinam o genoma de cada indivíduo, é possível na actualidade determinar com exactidão identidades desconhecidas. As sequências de nucleótidos que definem a molécula de DNA são a pista para
o descobrimento de quem somos. Contudo, devido à existência de milhões de sequências nucleótidicas, a tarefa torna-se demorada e complicada. Em vez disso, investigadores solucionaram a tarefa com a utilização de um método muito mais rápido, que se baseia na existência de padrões repetitivos de DNA, denominados, na ciência forense, de DNA minissatélites. Os cientistas seleccionam determinadas enzimas de restrição, que dividem o DNA nestes segmentos de restrição cujas dimensões, composição em nucleótidos e localização variam muito de pessoa para pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.
Assim, diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos a electroforese. Esta técnica baseia-se na migração de moléculas carregadas por aplicação de um campo eléctrico. Quando sujeitos a um campo eléctrico, os ácidos nucleícos migram em direcção ao pólo positivo, uma vez que apresentam carga negativa. Este processo é frequentemente utilizado para separar e algumas vezes purificar macro moléculas, especialmente proteínas e ácidos nucleícos, com base no seu tamanho, carga eléctrica ou conformação. A electroforese de ácidos nucleícos é realizada geralmente em géis de agarose ou de poliacrilamida. A electroforese em gel é frequentemente utilizada para estimar o tamanho de fragmentos de ácidos nucleícos e deste modo, através da comparação da distância percorrida pelos fragmentos de material genético é possível inferir sobre o peso molecular de cada fragmento da amostra analisada. Terminada a separação electroforética, o gel deve ser imerso numa solução de brometo de etídeo que permitirá a visualização das bandas de DNA por exposição a luz ultravioleta
As principais aplicações desta técnica são a genética forense e a determinação de paternidade.
Fontes: http://www.engenharia-genetica12.blogspot.com/
A técnica do DNA complementar é método utilizado para obter bibliotecas genómicas sendo vezes útil para a técnica de DNA recombinante. O seu DNA tem origem em mRNA que já sofreu o processo de splicing, ou seja,
mRNA maduro formado por complementaridade de bases. Este Arn não possui intrões pelo que a cadeia de DNA sintetizada não tem informação desnecessáriaO processo de ADN complementar necessita da utilização da enzima transcriptase reversa que permite obter DNA a partir de RNA. Após a formação da cadeia através da transcriptase reversa, uma enzima viral, dá-se a formação de outra cadeia por acção da DNA polimerase, formando-se assim uma molécula de DNA estável de dupla cadeia a partir dos nucleótidos dispersos no meio.
A molécula de DNA formada passa assim a fazer parte do material genético da célula alvo sob a forma de um plasmídeo que também codifica informação para a síntese proteica. Sendo a molécula de RNA instável e numericamente limitada, a utilização da transcriptase reversa para a obtenção do seu DNA complementar abriu um importante caminho para a biologia molecular. Desta forma, a possibilidade de se trabalhar com cDNA ao contrário de RNA tem facilitado o trabalho de investigadores, já que esta é quimicamente estável, de fácil manuseamento e a sua multiplicação é possível graças a técnicas como a PCR.
Esta técnica revolucionou o campo da biologia molecular, uma vez que permitiu alterar o genoma de diferentes organismos de modo a os tornar úteis ao ser humano.
Técnica do DNA recombinante (cDNA)
Durante 25 anos a comunidade científica deparou-se com o problema de encontrar um gene e de o separar da restante cadeia polinucleotídica.
O isolamento de substâncias capazes de
fragmentar e ligar o DNA em locais específicos, sendo estas as enzimas de restrição e DNA ligases, respectivamente, deu um grande impulso à Engenharia Genética. Esta descoberta proporcionou à Ciência a capacidade não só de manipular genes, mas também de os transferir entre moléculas de DNA, surgindo deste modo a Técnica de DNA Recombinante.As enzimas de restrição são substâncias responsáveis pela cisão da cadeia de DNA ao encontrar uma sequência de bases específica, chamada zona de restrição. As enzimas, após o reconhecimento destas sequências (de 5’ para 3’), destroem a ligação fosfodiéster entre dois nucleótidos consecutivos (os dois primeiros da cadeia reconhecida e os dois últimos da cadeia oposta), fragmentando o DNA e dando origem às extremidades coesivas, que contêm a sequência reconhecida. Estes fragmentos podem ser combinados com outras pequenas porções de DNA pela acção de DNA Ligases.
As especificidade das sequências reconhecidas está na base da existência de um grande número de diferentes enzimas de restrição, que originam assim cadeias com diferentes sequências.
Inicialmente dá-se a cisão do DNA da molécula dadora por acção de uma enzima de restrição especifica para a sequência em causa, isolando-se o gene que se pretende manipular. Por actuação dessa mesma enzima no vector, e posterior uso de DNA ligases, é possível incorporar esse mesmo gene neste. No caso das bactérias, esse vector é frequentemente um bacteriófago.
A entidade receptora é colocada em contacto com o bacteriófago, ou outro vector, de modo a que o DNA deste seja incorporado sob a forma de um plasmídeo junto a esta.
Esta técnica traz grandes vantagens para o nosso quotidiano, permitindo produzir proteínas raras em grandes quantidades para o tratamento de doenças e fabrico de vacinas. Além disso contribui para o melhoramento animal e vegetal, bem como para a terapia genética.
Reacção de Polimerização em Cadeia (PCR)
Kary Mullis é tido como pai da técnica de PCR, uma vez que em 1983 desenvolveu estudos que permitiram pela primeira vez a obtenção de cópias de DNA através de uma só molécula inicial. O processo fundamental que se encontra por de trás desta técnica é a replicação de DNA “in vivo”.
Inicialmente, extrai-se o fragmento de material genético a estudar da célula sem o danificar. Depois de extraído, é adicionado ao fragmento uma mistura que contém nucleótidos e a enzima DNA polimerase. Toda esta mistura é colocada numa máquina de PCR especializada, o termo-ciclador, que executa ciclos de temperatura preestabelecidos com tempos exactos. Na primeira etapa do ciclo, a temperatura é elevada a 94ºC num pequeno espaço de tempo para que ocorra a separação da dupla cadeia de DNA a amplificar. Na segunda etapa do processo, dá se uma diminuição da temperatura para cerca de 60ºC, de modo a que os iniciadores (segmentos de DNA em cadeia simples e geralmente constituídos por 15 a 30 nucleótidos), obtidos por síntese química, sem emparelhem com o DNA. Para amplificar uma determinada zona são necessários dois iniciadores complementares das sequências que se encontram no inicio do fragmento de ADN a amplificar, nas terminais 3’, de forma a permitir a actuação da DNA polimerase durante a síntese da cadeia complementar. Numa ultima etapa, a temperatura é elevada a 72º para que a DNA polimerase possa actuar, sintetizando a nova molécula a ser formada.
O resultado de todo este processo é visualizado e analisado através de uma electroforese em gel de agarose.
Impressões digitais genéticas ou DNA fingerprinting
A estrutura de DNA de cada ser vivo é única. Usando somente as sequências que determinam o genoma de cada indivíduo, é possível na actualidade determinar com exactidão identidades desconhecidas. As sequências de nucleótidos que definem a molécula de DNA são a pista para
o descobrimento de quem somos. Contudo, devido à existência de milhões de sequências nucleótidicas, a tarefa torna-se demorada e complicada. Em vez disso, investigadores solucionaram a tarefa com a utilização de um método muito mais rápido, que se baseia na existência de padrões repetitivos de DNA, denominados, na ciência forense, de DNA minissatélites. Os cientistas seleccionam determinadas enzimas de restrição, que dividem o DNA nestes segmentos de restrição cujas dimensões, composição em nucleótidos e localização variam muito de pessoa para pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.Assim, diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos a electroforese. Esta técnica baseia-se na migração de moléculas carregadas por aplicação de um campo eléctrico. Quando sujeitos a um campo eléctrico, os ácidos nucleícos migram em direcção ao pólo positivo, uma vez que apresentam carga negativa. Este processo é frequentemente utilizado para separar e algumas vezes purificar macro moléculas, especialmente proteínas e ácidos nucleícos, com base no seu tamanho, carga eléctrica ou conformação. A electroforese de ácidos nucleícos é realizada geralmente em géis de agarose ou de poliacrilamida. A electroforese em gel é frequentemente utilizada para estimar o tamanho de fragmentos de ácidos nucleícos e deste modo, através da comparação da distância percorrida pelos fragmentos de material genético é possível inferir sobre o peso molecular de cada fragmento da amostra analisada. Terminada a separação electroforética, o gel deve ser imerso numa solução de brometo de etídeo que permitirá a visualização das bandas de DNA por exposição a luz ultravioleta
As principais aplicações desta técnica são a genética forense e a determinação de paternidade.
Fontes: http://www.engenharia-genetica12.blogspot.com/
